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有时候,选择比努力更重要。

人阅读 发布时间:2019-02-28 11:56

可还记得,曾经一个拥有北京一套四合院的中国人,年轻的时候为了出国留学,卖掉了四合院,在美国风餐露宿打拼了一辈子,年老时准备回北京暗度万年,却意外发现自己当年卖掉的那个四合院,现在挂牌7000万。                        
有时候我们勤勤恳恳地努力了一辈子,却得不到想要的结果,或许只是当初的选择错了。

选择一个好的抗体,可以让你的WB实验顺风顺水。

WB实验全称是Western Blot,中文叫蛋白免疫印记实验,一个完整的WB实验大致包括蛋白分离,膜转移,一抗二抗孵育,凝胶成像。今天我们先推荐给大家的是CST抗体,作为一个国际大牌,CST专注于各种抗体的研发,针对每一个抗体都经过多种细胞反复验证。

此外,在WB实验的过程中,会遇到各种各样的问题,每一个小问题的出现都有可能会造成实验的失败。

一、最常见的背景过高
原因:1.转膜后封闭不完全,建议延长封闭时间,增加封闭液浓度。
      2.封闭液和抗体能交叉反应,建议更换封闭液。
      3.洗膜不充分,一般建议洗膜3次,每次10min,建议根据实验结果进行调整。
      
二、无条带出现,或信号较弱
原因:1.转移蛋白失败,建议优化胶的浓度,转移时间和电流,同时采用预染marker帮助监控转印过程。
      2.一抗浓度不适合,建议起始浓度可以按照1:100,1:500,1:1000,1:5000进行稀释,若一抗亲和力较低,应使用无Tween溶液。此外可独立点膜,验证二抗和发光液预混后曝光,可清晰看到膜上的点即可,否则需检测二抗效价或发光液效果。
      3.样本量不够,建议浓缩样本,并使用高灵敏度的成像检测体系。
      4.蛋白和膜的结合较弱,建议转膜溶液中降低SDS含量或不加SDS,使用新换的膜以确定正确的水合作用。

三、印迹条带与预期不同
原因:蛋白质的大小会改变其在膜上的迁移速度,一般蛋白越小,迁移越快。例如有些蛋白会磷酸化或糖基化,从而增加蛋白质的大小,使得条带跑的相对较慢。建议充分了解该蛋白的翻译修饰过程,避免造成结果的误读。

四、转膜选择湿转还是半干
原因:湿转用时较长,较适用于大分子蛋白和疏水蛋白等较难转印的蛋白,而半干法转膜时间较快,但膜可能会干掉,导致蛋白无法转印。CST专家建议使用湿法转膜,经验证抗体孵育后实验结果更加可靠。

五、检测重组蛋白时难以获得条带
原因:重组蛋白可能带有标签,阻止了抗体接近表位。建议尽可能让标签位于重组蛋白的CN端,而不是位于蛋白质阅读框内,从而降低阻碍的发生,同时,我们始终推荐使用内源性阳性对照。

六、出现了“笑脸型”或“皱眉型”条带
原因:通常是由于凝胶不均匀冷却,中间冷却不充分,或者电泳系统温度偏高,一般在较厚的凝胶中会发生。此外凝胶中含有气泡时,也会出现条带拖尾现象。建议制胶过程需放慢,转膜过程中应加入冰块,降低电泳温度。

如果你也在为WB实验烦恼,那就来一起探讨一下吧。
 

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